Título

DETERMINAÇAO DE GENES DE REFERENCIA COMO PADRAO QUANTITATIVO PARA ANALISES DE EXPRESSAO GENICA EM MODELO DE FIBROSE IN VITRO COM CELULAS MESANGIAIS ESTIMULADAS COM TGF-Β

Introdução

A reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR) constitui padrão ouro para análises de expressão gênica, porém a escolha de genes de referência quantitativos ainda é um desafio, pois suas expressões podem variar na dependência do modelo experimental. A identificação do melhor gene de referência (housekeeping gene, HKG) para um determinado modelo experimental é um ponto chave para estimar o nível de expressão de genes alvos, permitindo a obtenção de resultados confiáveis e reprodutíveis. O objetivo deste estudo é identificar o melhor HKG em estudos utilizando modelo in vitro de fibrose com células mesangiais estimuladas com TGF-β, extensamente utilizado em pesquisa básica.

Material e Método

Células mesangiais foram cultivadas e divididas em dois grupos: controle (CT, n=6) e estimulado com 5 ng/mL de TGF-β (5T, n=6). Os HKG candidatos foram selecionados com base na utilização em artigos publicados, sendo eles Actb, Hprt, Gapdh, 18S e Ppia. Após expressão quantitativa e melhor combinação desses genes foi analisada in sílico utilizando seis softwares (NormFinder, GeNorm, RefFinder, Método ΔCt, BestKeeper e DataAssist). Para validar os resultados, os melhores genes foram utilizados para normalizar a expressão gênica de genes alvos incluindo fibronectina, vimentina e ɑSMA.

Resultados

As análises in sílico apontaram os genes Ppia, Gapdh e 18S como os mais estáveis entre os dois grupos. O software GenEx determinou que a utilização de dois genes é melhor para análise de expressão gênica nesse modelo, sendo a combinação de Ppia e Gapdh o melhor par de HKG. A validação dos HKG através da normalização de fibronectina, vimentina e ɑSMA foram consistentes com a observada na literatura, aumentando a expressão no grupo estimulado com TGF-β quando comparado com o grupo controle.

Discussão e Conclusões

Esse estudo estabeleceu a combinação de Ppia e Gapdh como os melhores HKG para análises de expressão gênica por RT-qPCR em modelo de células mesangiais estimuladas com TGF-β.

Palavras Chave

housekeeping genes, genes de referências, células mesangiais, TGF-β, RT-PCR.

Área

Ciências básicas

Instituições

Universidade Federal de São Paulo - São Paulo - São Paulo - Brasil

Autores

Bruno Aristides dos Santos Bronel, Ana Carolina Anauate, Edgar Maquigussa, Mirian Aparecida Boim, Antônio da Silva Novaes