Dados do Trabalho

Título

Acessando leituras longas de alta qualidade pelo sequenciamento de DNA de nanoporos para genotipagem HLA

Introdução

Plataformas de sequenciamento de DNA de nova geração (NGS) de leituras curtas são empregadas na genotipagem HLA de alta resolução apesar das possíveis ambiguidades de tipagem. Leituras longas e, recentemente, com alta acurácia (Q30; 99,9%) foram obtidas de NGS por nanoporos. Neste trabalho, verificamos o impacto de algoritmos de basecalling na genotipagem HLA via NGS por nanoporos.

Material e Método

DNA de dois indivíduos sadios foi isolado. Amplificação de onze genes HLA clássicos, preparo da biblioteca pelo método de ligação e sequenciamento por nanoporos seguiram protocolo comercial em teste beta (NGSTurbo, GenDx). Para comparar a performance dos diferentes algoritmos de basecalling, os dados brutos foram submetidos de maneira independente a quatro algoritmos do pacote Dorado (Nanopore): três para leituras simplex - fast, high accuracy(hac), superior(sup) e um para leituras duplex. Arquivos fastQ foram analisados no software fornecido com o kit (NGSTurbo 0.1.0). Concordância com genotipagem prévia e métricas associadas ao nível de ruído foram mensuradas.

Resultados

Pior perfil de ruído foi observado no algoritmo fast (ruído máximo éxon%: 38,7[9,9]; intervalo sinal-ruído%: -0,6[10,7]), seguido por hac (24,2[6,2]; 17[4,5]) e sup (30,2[6,6]; 12,7[4]). Leituras duplex apresentaram o melhor perfil de qualidade (35,7[8,2]; 6,1[3,5], p<0,05). Duas divergências no genótipo para HLA-A foram encontradas apenas no algoritmo fast. Nos demais algoritmos, um alelo novo HLA-B e um alelo nulo HLA-DPB1 foram confirmados.

Discussão e Conclusões

Maiores leituras, menor número de ambiguidades e preparo de bancada mais simples são características do NGS por nanoporos. Além disso, alta acurácia obtida de leituras duplex, conforme demonstrado, podem tornar esta metodologia alternativa viável à rotina clínica de genotipagem HLA.

Palavras Chave

HLA, sequenciamento de nova geração, histocompatibilidade, nanoporos, algoritmo